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martes, 3 de junio de 2014

Observación al microscopio



Observación al microscopio
La observación  es el último paso de la técnica histológica, en la cual una vez obtenida la laminilla histológica se observara al microscopio, primeramente se enfocara con la lupa a 4x, se prosigue con el lente de 10x y por último se observara el tejido en 40x.
Los resultados obtenidos mediante la tinción al ser observadas al microscopio pueden presentar las siguientes coloraciones:
X  Núcleo de azul.
X  Citoplasmas y fibra colágenas de rojo o rosa.

X  Eritrocitos de rojo brillante.

Montaje


Montaje

Este paso consiste en colocar sobre el corte, un cubreobjetos bien limpio con una gota del medio de montaje, evitando que se formen burbujas de aire, el medio de montaje más frecuentemente utilizado es el Bálsamo de Canadá o resina.
Se deja secar la resina  y ya está lista la preparación para ser observada.

El objetivo del montaje es facilitar el examen microscópico y conservar las preparaciones.

Tren de Tinción de Hematoxilina y Eosina

Técnica:
La canastilla con las láminas se someten a baños en las diferentes soluciones:
Técnica Estandarizada
1.    Xilol - 15 minutos
2.    Xilol - 10 baños
3.    Alcohol absoluto - 10 baños
4.    Alcohol absoluto - 10 baños
5.    Alcohol 96° - 10 baños
6.    Alcohol 96° - 10 baños
7.    Agua corriente - 10 baños
8.    Hematoxilina (5 min. Estandarizar)
9.    Agua corriente - 10 baños
10.  Alcohol ácido (baño rápido) 
11.  Agua corriente -10 baños
12.  Carbonato de Litio - Estandarizar
13.  Agua corriente - 10 baños
14.  Alcohol 96° - 10 baños
15.  Eosina (Estandarizar)
16.  Alcohol 96° - 10 baños
17.  Alcohol 96° - 10 baños
18.  Alcohol Absoluto - 10 baños
19.  Alcohol absoluto (Se seca la laminillaen el horno 2 min).
20.  Xilol - 10 baños
21.  Xilol 

Tinción

Tinción
Se llama tinción al procedimiento mediante el cual se tiñen las preparaciones histológicas, fundándose en la afinidad que para determinados agentes colorantes poseen los diversos componentes de la célula y substancias intercelulares, siendo indispensable que nos se destiñen con un lavado ulterior efectuado con el disolvente empleado para preparar la solución.
El término  de agente colorante es utilizado en un amplio sentido, e incluye a todas las substancias que son capaces de combinarse con los tejidos y mejorar la visibilidad de sus componentes al impartirles color, siendo necesario que no tiñan difusamente por igual a los componentes de un preparado, sino que se fije selectivamente en determinados elementos en forma constante y regular.
Los colorantes básicos reaccionan con los grupos aniónicos de los componentes texturales, que son los grupos fosfato de los ácidos nucleicos (ADN y RNA), los grupos sulfato de los glucosaminoglucanos y los grupos carboxilo de las proteínas. la reacción de estos grupos varía según el ph.
La hematoxilina no es un colorante básico en sentido estricto. se la utiliza con un mordiente (intermediario), entre el componente textural y la anilina, y es debido a este que la coloración con hematoxilina se asemeja a la tinción que produce un colorante básico. la unión en el complejo tejido – mordiente – hematoxilina, no consiste en un simple enlace, y cuando la hematoxilina se coloca en agua no se disocia del tejido, sino que permanece firmemente adherida. a causa de esto, la hematoxilina se presta para aquellos procedimientos tintoriales en los que a ella le sigue la eosina u otros colorantes ácidos.
Los colorantes básicos verdaderos no suelen usarse en secuencia en donde el colorante básico es seguido por uno ácido, por que la anilina básica tiende a disociarse del tejido durante los lavados posteriores en soluciones acuosas.
Un colorante ácido lleva una carga negativa en la porción coloreada de la molécula y su fórmula general se representa:
na+ anilina-
Los colorantes ácidos se unen primariamente a los componentes texturales por medio de enlaces electrostáticos de manera similar pero opuesta a la de los colorantes básicos. las anilinas ácidas reaccionan con grupos catiónicos, como los grupos amino ionizados de las proteínas.
Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante básico (o con hematoxilina) se dice que es basófilo y que presenta basofilia. estos componentes son:
X  la heterocromatina y los nucleolos del núcleo por los grupos fosfato ionizados.
X  ergatoplasma (parte del citoplasma) por grupos fosfato ionizados.
X  matriz del cartílago por grupos sulfato ionizados.

Los componentes texturales que se tiñen de colorantes ácidos se dice que son acidófilos y que presentan acidofilia.
Son acidofilos:
X  la mayor parte del citoplasma no especializado.
X  filamentos citoplasmáticos.  
X  fibras extracelulares.
Todos estos debidos a grupos amino ionizados.
Los colorantes más utilizados son la HEMATOXILINA Y la EOSINA.
La EOSINA es un colorante ácido y sus propiedades tintoriales pueden ser explicadas sobre la base de lo que se sabe acerca de la acción de las anilinas ácidas. La HEMATOXILINA aunque no es un colorante básico, posee propiedades muy semejantes a las anilinas básicas.
COLORANTES:
X  Básicos: HEMATOXILINA (Núcleo Azul)

X  Ácidos: EOSINA (Citoplasma Rosa)

Desparafinado

Desparafinado


Después de extender y montar el corte en una laminilla el corte debe ser secado para evitar su desprendimiento y desparafinar los cortes, la desparafinación se lleva acabo introduciendo las laminillas acomodadas en una canastilla de portaobjetos, a la estufa a una temperatura de 60ºC por 30 minutos.

Afilado de cuchillas

Afilado de cuchillas

Se lleva acabo mediante un aparato llamado afilador de cuchillas el cuál tiene uso exclusivo para la afilación.

Este se realiza antes de empezar a realizar la técnica ya que las cuchillas deben de estar afiladas para que el corte que se hacen en la microtomía sea un corte fino.

Los pasos son los siguientes para afilar las cuchillas:
X  Se lija la superficie de la cuchilla para retirar el oxido sin tocar el filo.
X  Se coloca el vidrio esmerilado para limar y sobre de este se coloca el abrasivo ya sea grueso o fino ( haciendo una línea recta y sobre de esta un zig-zag).

X  Se le da el tiempo correspondiente que se requiera para su afilación

Microtomía y baño de flotación


Los tejidos deben ser cortados en láminas delgadas para posibilitar su observación con el microscopio, los instrumentos utilizados para la obtención de cortes son los micrótomos. Básicamente, todos los tipos de micrótomo constan de una navaja muy afilada que seccionará el taco histológico y un mecanismo de avance automático regulable de a unos pocos micrones (usualmente entre 5 y 8 micras).

El espesor de los cortes  se hace mediante un tornillo micrométrico, sus pasos de rosca son muy estrechos. Al avanzar, empuja el bloque portamaterial por una rampa oblicua al plano de deslizamiento de la cuchilla. Para hacerlo avanzar hay una palanca lateral, una especie de brazo y un tope.
Elegido el espesor que se desea dar a los cortes, se desliza la cuchilla. Se hace el primer corte.

Los cortes que naturalmente salen ondulados se extienden y alisan por completo mediante el agregado al baño de flotación a 45ºC al cual se le agrega grenetina para que se fije adecuadamente al portaobjetos al momento de recoger el tejido.

El corte puede ser sujetado por una aguja de montaje, se levanta el porta y se extrae del agua junto con el corte en el centro del porta. 

Inclusión

A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos para ser observados al microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme. Las sustancias usadas para este fin son: gelatina y parafina.
El objeto de la inclusión es:
X  Distinguir entre sí las células superpuestas en un tejido y la matriz extracelular.
X  Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte.
La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido. Por lo general se coloca la muestra de tejido en un recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60º C, colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a 6 horas manteniendo la temperatura a 60º C.

Debido al calor, el xilol o el benzol se evaporan y los espacios anteriormente ocupados por ellos son ahora ocupados por la parafina. Después se coloca la pieza y un poco de parafina fundida en un molde de papel o metal de forma rectangular y se deja solidificar a temperatura ambiente, formándose un bloque sólido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este bloque se le denomina Taco.

Tren de Deshidratación

Después que la muestra ha sido fijada se elimina el fijador y se deshidrata. Debido a que una gran parte del tejido está constituida por agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante. Los pasos para realizar la deshidratación son los siguientes:
1ª Cubeta: Formol 1 hora

2ª Cubeta: Formol 1 hora

3ª Cubeta: Alcohol 60% 1 hora

4ª Cubeta: Alcohol 80% 1 hora

5ª Cubeta: Alcohol 96% 1 hora

6ª Cubeta: Alcohol absoluto 1 hora

7ª Cubeta: Alcohol abosoluto 1 hora

8ª Cubeta: Alcohol absoluto 1 hora

9ª Cubeta: Xilol 1 hora

10ª Cubeta: Xilol 1 hora

11ª Cubeta: Parafina 1 hora
12ª Cubeta: Parafina 1 hora

Todo este proceso se lleva a cabo mediante un equipo de laboratorio llamado Histokinett

Histokinette

Los procesadores automáticos de tejidos perfeccionan el procesamiento de los mismos mediante el uso de calor, vacío, presión y agitación.
El histokinette es el equipo para procesar tejidos blandos, estos procesadores automáticos varían en el diseño de su tecnología, el más común consta de 12 pasos de una hora cada uno en recipientes de 1l.  de capacidad para sus soluciones correspondientes.
El tiempo de proceso o inmersión en cada uno de los pasos depende del tipo de equipo con el que se cuente, por lo general de 12 a 14 horas aproximadamente.
En ocasiones puede funcionar erráticamente dando por resultado especímenes resecados, quemados y mal deshidratados. La limpieza  y cambio de soluciones es indispensable para un buen proceso de deshidratación.

Acción de los solventes

Formol: Su función es fijar el tejido es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos. 

Alcohol: debido a que una gran parte del tejido está constituida por agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante. Iniciando con alcohol al 60%, 80%, 96% y absoluto.

Xilol: es una solución que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusión a utilizar. Esta fase se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción.

Parafina: al infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, se disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido. La parafina debe estar fundida a 60º C,.Debido al calor, el xilol o el benzol se evaporan y los espacios anteriormente ocupados por ellos son ahora ocupados por la parafina.

Como trabaja un Fijador y Tipos de Fijadores

Manera de actuar de los fijadores 

De acuerdo a su composición o naturaleza: estabilizan las proteínas sin combinarse con ellas (alcohol, ácido pícrico, yodo, calor), formando enlaces químicos con las moléculas orgánicas (ácido crómico y sus sales), o reduciéndose en contacto con las mismas, lo que origina un precipitado sumamente fino (ácido ósmico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).
La mayoría de los fijadores producen cierto endurecimiento tisular, lo cual facilita el corte, sin embargo, este efecto es complementado por el uso de alcoholes en concentraciones progresivamente crecientes, que son empleados en el proceso de la deshidratación.

La mayor parte de los fijadores actúan como oxidantes, favoreciendo así la coloración y tinción de los tejidos, además de incrementar la diferenciación óptica de las estructuras celulares y tisulares. Asimismo, favorecen la resistencia celular a las soluciones hipo e hipertónicas que son empleadas después de la fijación, lo cual reduce el riesgo de infección en las personas que manejan los especímenes.

Tipos de fijadores

Los fijadores se clasifican de acuerdo con su composición química en:
X  Fijadores Simples, constituidos por una sola sustancia química.
X  Fijadores compuestos o mezclas fijadoras constituidos por varias sustancias.

FIJADORES SIMPLES:

a) Formol al 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar órganos o tejidos para estudios histológicos topográficos.
b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica.
c) Alcohol metílico, se emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc.).
d) Ácido ósmico al 1 ó 2%, poca penetración pero enérgico, conserva muy bien estructuras celulares.

FIJADORES COMPUESTOS:

En su composición intervienen un número variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de complementar la acción de cada uno de ellos o atenuar sus defectos.
a) Líquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-acética.
b) Líquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-acética.
c) Líquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
d) Líquido de Bouin, mezcla picro-formos-acética.

FIJADORES FÍSICOS:

1. Desecación.
2. Calor seco.
3. Calor húmedo.
4. Frío.

5. Congelación y desecación.

Cualidades ideales que debe tener un fijador





X  Actuar con rapidez, fijando a las células antes de que se inicien los fenómenos pre-mortem y post-mortem (autólisis, fragmentación, desintegración, etc.).
X  Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta las porciones profundas del espécimen, en función de sus dimensiones.
X  Conservar, en la medida de lo posible, los detalles estructurales en un patrón morfológico similar al que presentaban in vivo.
X  Permitir o favorecer la aplicación de los procedimientos requeridos para su observación: procesamiento, inclusión en parafina, corte, tinción y observación, así como la realización de técnicas histológicas, histoquímicas o inmuno-histoquímicas específicas.  
X  Evitar la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella.
X  Impedir la generación de estructuras artificiales (artificios y artefactos).
X  No generar retracción excesiva de los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.

X  Ser económico, estable, con baja toxicidad y de fácil manejo.

Fijación

En forma inmediata, posterior a la extracción de la pieza o tejido producto de estudio, éste deberá ser colocado en un recipiente apropiado y fijado e identificado en forma precisa y adecuada, señalando: nombre, fecha y origen del mismo. El fijador utilizado con mayor frecuencia es el formaldehído. Deberá tomarse en consideración que el volumen de fijador corresponda al tamaño de la muestra (aprox. 3 a 10 veces el volumen de la misma).
La separación de un tejido del resto del organismo, implica automáticamente pérdida de su irrigación sanguínea, lo cual conduce a una serie de eventos metabólicos que culminan rápidamente con el proceso denominado autólisis, consecuencia de la acción enzimática derivada de la falta de oxígeno y aporte de metabolitos esenciales que resultan en daño y destrucción celular.
Este fenómeno sucede igualmente al ocurrir la muerte del individuo. La rapidez de la descomposición de los tejidos y órganos, será proporcional a la actividad metabólica propia de los mismos, a la acción bacteriana y a la temperatura ambiente. Para preservar el estado de las células y los tejidos, es indispensable frenar en forma temprana dichos procesos, lo cual se lleva a cabo mediante la acción del fijador.
La fijación consiste en sumergir el tejido o perfundir el órgano en compuestos químicos denominados fijadores, que corresponden a soluciones líquidas como el: formaldehído, cloruro de mercurio, ácido pícrico, alcohol etílico, ácido tricloroacético, acetona, formalina ó el glutaraldehído, que son denominados  fijadores simples. Tambíen puede emplearse la combinación de una o más sustancias fijadoras, que en función de las características del espécimen incrementan la calidad de la fijación como ocurre con la solución de Bouin, que contiene ácido pícrico, formalina, ácido acético y agua. Otro ejemplo es la solución de Zenker, que contiene formalina, dicromato de potasio, cloruro de mercurio y agua. Como señalamos anteriormente el fijador mas comúnmente usado es el formaldehído, y se recomienda usarlo al 10% con buffer de fosfatos. Otro fijador útil especialmente para estudios de microscopía electrónica es el glutaraldehído, que a su vez también puede combinarse con formaldehído y que requiere un procedimiento especial asociado a tetraóxido  de osmio.
El proceso de fijación se refiere al tratamiento del tejido con sustancias quimicas que tiene varias finalidades:
1.    Conservar los tejidos de forma que muestren el mayor parecido posible a su estado in vivo.
2.    Aumentar la dureza del tejido para facilitar la preparación de finas películas de éste.
3.    Destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en ellos.
4.    Interrumpir los procesos celulares dinámicos que ocurren a la muerte de la célula.
Esto se logra al inactivar ciertas enzimas celulares que de otra manera iniciarían la Autolisis y llevarían a la degeneración post mortem.

La fijación mantiene las estructuras al estimular la formación de enlaces cruzados entre las proteínas.

Toma u obtención de la muestra

Como primer paso, en cualquier Técnica Histológica e Histopatológica es obtener la pieza o tejido que vayamos a estudiar, ya sea riñón, piel, hígado, cerebro, etc.

Este consiste en la provisión del material que se desea estudiar por medio del microscopio. El método seleccionado debe ser el adecuado para cada tipo de material.

En todos los casos el instrumental con el cual se seccionan los tejidos debe estar muy afilado para evitar aplastar sus elementos, así como se debe evitar cualquier otro tipo de maltrato en su manipulación. 
Existen 2 formas en las que se puede obtener la muestra del tejido:
X  Necropsia: Examen u obtención de tejido de un organismo muerto.
X  Biopsia: Examen u obtención de tejido de un organismo vivo. Puede ser incisional, excisional, por sacabocado, por punción y absorción, por raspado, por trepanación.

En la obtención del material histológico hay que cumplir con varias reglas como ser:

1.- Realizar la toma del tejido en el lugar correcto.

2.- Instalarse cómodamente bajo una buena luz, sobre una amplia plancha de corcho colocado dentro de un recipiente estanco donde se puedan escurrir y recoger los líquidos fijadores o los productos patológicos.

3.- Protegerse con guantes, delantal de materia plástica y lentes protectoras contra salpicaduras. Deberá contar además con la colaboración de un técnico de laboratorio.

X  Tener muy cerca:
a) Una entrada de agua corriente provista de ducha, diversos fijadores, una balanza de lectura directa, una regla dividida en mm, transparente y de materia plástica, un hilo resistente destinado a medir circunferencias y curvaturas, un tapón de corcho grueso, tipo desagüe, pinzas sin dientes (preferiblemente largas y suaves) para coger fácilmente y sin destrozar los pequeños fragmentos del fondo de un frasco de cuello estrecho, una sonda, unas tijeras de ramas largas y extremos puntiagudos, bisturís, cuchillos preferiblemente de hojas largas, anchas y planas, de acero inoxidable.

b) Empezar las extracciones por las biopsias y los pequeños fragmentos que son urgentes y que peligran ulteriormente de ser descuidados o confundidos. Continuar con las piezas operatorias y las extracciones más voluminosas.

c) En la toma de muestra es importante orientarnos de que zona vamos a tomar la muestra, para ello se hace un estudio topográfico.

d) En caso de tratarse de órganos pares para el lado izquierdo el corte debe de ser en forma triangular y para el lado derecho en forma de cuadrado esto se hace para hacer una diferenciación entre los órganos.

e) La extracción se efectuará además de lo más delicadamente posible, evitando magullar los tejidos bajo el esfuerzo de una pinza demasiado apretada, de un bisturí  mal afilado.

4.- Es preciso obrar con cuidado y precaución, a fin de evitar la destrucción de los tejidos.

5.- Cortar la pieza de órganos macizos en trozos pequeños (entre 1 y 3cm x 0,5cm) teniendo en cuenta la configuración anatómica.

7.- Realizar este proceso con la mayor rapidez posible para evitar la autodestrucción del tejido (autólisis).


Una vez tomada la pieza histológica, debemos evitar el proceso de autolisis (destrucción y putrefacción) celular que ocurra en éstos tejidos, para lo cual nos valemos de ciertas substancias químicas que sabemos evitan ésta destrucción. Esto en el caso de la histología normal, es con el propósito de estudiar los tejidos con toda su estructura normal, con el mínimo de cambios microscópicos. Por lo cual una vez tomada la muestra esta debe de fijarse inmediatamente en recipientes apropiados y el volumen de fijador debe de ser 10 veces mayor a la muestra fijada.

Inicio del Proceso Histológico

¿Qué es el proceso o la técnica Histológica?


Se denomina técnica histológica a los procedimientos a los que se somete una muestra de tejidos u órganos el cual se transformara en delgados cortes coloreados, a fin de que sea posible su observación y su estudio por medio del microscopio.

Este consiste en una serie de pasos:

X  Toma u obtención de la muestra
X  Fijación.
X  Deshidratación.
X  Inclusión.
X  Microtomía.
X  Baño de Flotación.
X  Secado de laminillas.
X  Desparafinado.
X  Tinción.
X  Montaje.

X  Observación al microscopio.

Material utilizado

§  Equipo:
X  Microtomo
X  Histoquinet
X  Afilador de cuchillas
X  Baño de flotación
X  Estufa
X  Microscopio
X  Refrigerador

§  Material:
X  Agujas de montaje
X  Matraz Erlenmeyer
X  Probeta
X  Pipetas
X  Portaobjetos y cubreobjetos
X  Canastilla para tinción
X  Vaso de precipitado
X  Capsulas
X  Molde para inclusión

§  Reactivos:
X  Formol al 10%
X  Alcohol (60%, 80% y 96%)
X  Xilol
X  Alcohol absoluto
X  Parafina
X  Agua destilada y agua corriente
X  Agua amoniacal
X  Hematoxilina de Harris
X  Eosina